瞬時轉染原理及實驗步驟

哺乳動物細胞瞬時轉染能在短期內快速表達高活性蛋白而被廣泛應用。本文主要介紹了細胞瞬時轉染的步驟、原理,及血球計數板對細胞計數的原理和方法。哺乳動物細胞自身具有蛋白折疊和翻譯后修飾的功能,獲得的蛋白更具有天然活性。哺乳動物細胞生產蛋白的方式有兩種:瞬時轉染和穩定轉染。瞬時轉染的特點是短期快速表達,滿足蛋白的小量制備。而穩定轉染通過構建穩定細胞系能夠滿足蛋白的大量、長期生產。

下載

瞬時轉染是指將構建好的質粒通過某種方式導入到哺乳動物細胞內(主要指HEK293細胞),該質粒上的外源基因不整合到細胞自身的基因組上。隨著細胞的生長分裂,外源基因會逐漸丟失。質粒在細胞內能夠存在3-4天,此時間內,質粒外源基因在細胞內發生轉錄翻譯,得到極為少量的蛋白。這一整個快速轉染得到蛋白的過程就稱為瞬時轉染表達

瞬時轉染步驟

瞬時轉染流程簡圖

瞬時轉染流程簡圖

細胞復蘇

細胞復蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細胞株解凍并重新培養的過程。細胞復蘇的關鍵是快速。防止在解凍過程中,產生的水珠形成冰晶損傷細胞。細胞復蘇一般步驟如下:

  1. 預先加熱水浴鍋,溫度至37-40℃,并在離心管中準備好10ml培養基
  2. 從液氮罐或冰箱中取出細胞,迅速放進預熱的水浴鍋中,鑷子夾住凍存管晃動,使其受熱均勻
  3. 當凍存管內完全融化時,注意用酒精擦拭凍存管消毒,將液體倒入含有10ml培養基的離心管中
  4. 離心5min,去除上清,得到沉淀
  5. 用培養基懸浮沉淀,并接種到培養瓶常規細胞培養

細胞復蘇后,生長一段時間,95%的細胞貼壁生長,細胞狀態良好,說明細胞復蘇成功。

瞬轉步驟

以Lipofectamine轉染試劑為例的操作流程,不同轉染試劑參考說明書

  1. 將復蘇后常規培養的細胞按照1-3×105接種到6孔板中,加入2-4ml的完全培養基,混勻放置在二氧化碳培養箱中37℃過夜
  2. 無菌狀態下配置如下溶液:
    • a溶液 用100ul的無血清培養基稀釋2ug的待轉染的質粒
    • b溶液 用100ul的無血清培養基稀釋25ul的Lipofectamine轉染試劑(血清的存在會影響細胞轉染效率,因此要使用無血清培養基轉染)
  3. 將ab溶液混合并搖勻,室溫下放置30min左右
  4. 細胞培養至80%單層左右,用無血清培養基洗滌細胞2次,每孔加入1ml的無血清培養基,并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔,按十字方向輕搖混勻,二氧化碳培養箱中37℃培養24小時
  5. 將轉染液倒出,換為完全培養基繼續培養,培養3-4天后檢測蛋白表達量

轉染檢測

收集培養的細胞,采用超聲或酶解的方法破碎細胞,離心得到上清。轉染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。針對基因水平,使用普通PCR或RT-PCR進行驗證。蛋白水平,使用western blot檢測。

細胞計數

細胞計數的原理就是測定單位體積內細胞的數量從而得到細胞總濃度,在細胞培養和測定細胞生長曲線的過程中廣泛應用。本實驗是采用血球計數板對細胞計數,步驟如下:

  1. 將計數板的蓋玻片洗凈晾干,并消化細胞離心加入培養基懸浮細胞,制得細胞懸液
  2. 稀釋細胞懸液,按照一定的倍數
  3. 蓋玻片蓋上計數板表面,移液器吸取10ul左右的細胞懸液從血球計數板的一方慢慢注入到計數板上
  4. 蓋玻片具有引流的功能,因此只需輕輕打入到板上孔中即可
  5. 顯微鏡下觀察細胞,按照要求計數該血球計數板上的細胞個數,計數方式如圖所示

瞬時轉染血球計數板
瞬時轉染血球計數室表面

圖3 血球計數室表面

每個血球計數板有上下兩個計數室(如圖1)

草莓视频app无限观看每個計數室分為九大格(如圖3)

草莓视频app无限观看其中最中間的方格分為25個中格,每個中格又被分為16個小格,因此計數室中一共有400個小格。每次計數時選取圖3中紅色部分計數,計數結果乘以5得到一個計數室中總的細胞個數

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